Luận văn Xác định thành phần Hóa học và đặc điểm cấu trúc của Polysaccharide Sulfate được phân lập từ Rong nâu Sargassum Microcystum

Nội dung tài liệu: Luận văn Xác định thành phần Hóa học và đặc điểm cấu trúc của Polysaccharide Sulfate được phân lập từ Rong nâu Sargassum Microcystum

1. Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân và tham khảo thêm các tài liệu đáng tin cậy, có nguồn gốc rõ ràng. Các số liệu, kết quả trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn này. Nha Trang, ngày 25 tháng 12 năm 2020 Tác giả luận văn Trần Nữ Ngọc Minh
2. Lời cảm ơn Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp và bạn bè. Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân đã gợi mở cho tôi các ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành đề tài này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học và Phòng Đào tạo đã tổ chức công tác giảng dạy, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thiện luận văn và các thủ tục cần thiết. Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang cũng như các anh chị em công tác tại phòng Hóa Phân tích đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi làm thực nghiệm và luôn động viên, giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Sở Y tế Ninh Thuận, Trung tâm kiểm soát bệnh tật tỉnh Ninh Thuận đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thời gian học tập và nghiên cứu, hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bạn bè, những người thân luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này. Nha Trang, ngày 25 tháng 12 năm 2020 Xin chân thành cảm ơn! Trần Nữ Ngọc Minh
3. Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt Carbon-13 NMR 13C-NMR Spectroscopy Phổ CHTHN Carbon 13 Correlation Phổ tương tác hai chiều COSY Spectroscopy đồng hạt nhân DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxid 4,4-dimethyl-4- Axit 4,4-dimethyl-4- silapentane-1-sulfonic silapentane-1-sulfonic DSS acid EtOH Ethanol Ethanol Electron Spray Ionization Phổ khối ion hóa bằng - Mass nguồn mù electron ESI-MS Electron Spray Ionization Phổ khối ion hóa bằng - Mass/Spray Ionization - nguồn mù electron hai Mass lần ESI-MS/MS Fuc Fucose Đường fucose Fucf Fucofuranose Fucofuranose Fucp Fucopyranose Fucopyranose Gal Galactose Đường galactose GlaNA N-Acetylgalactosamine Đường N- Acetylgalactosamine Gel permeation GPC chromatography Sắc ký lọc gel
4. Gluc Glucose Đường glucose GlucA Glucuronic Axit Axit glucuronic HPLC High Performance Sắc ký lỏng cao áp Liquid Chromatography HSQC Heteronuclear Single Phổ tương tác dị nhân Quantum Coherence qua một liên kết 1H-NMR Proton NMR Phổ CHTHN proton Spectroscopy IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại desorption/ionization Man Mannose Đường mannose MeOH Methanol Methanol NMR Nuclear Magnetic Cộng hưởng từ hạt nhân Resonance (CHTHN) TFA Trifluoroacetic axit Axit trifluoroacetic TMS Tetra metyl silan Tetra metyl silan Xyl Xylose Đường xylose
5. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hoá học (%) của một số loài rong biển. ...................... 11 Bảng 1.2. Thành phần hóa học của một số Fucoidan .................................... 18 Bảng 1.3. Sự phân bố trọng lượng phân tử của Fucoidan .............................. 25 Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học của các Fucoidan từ một số loài rong nâu .. 30 Bảng 1.5. Hàm lượng, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu Fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam .36 Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu Fucoidan trên các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD 38 Bảng 2.1. Các mảnh đặc trưng cho các sulfate fucose có nhóm sulfate ở các vị trí khác nhau trong phổ khối dạng ion âm ...47 Bảng 3.1. Hàm lượng thu nhận và thành phần hóa học Fucoidan từ hai khu vực biển khác nhau ..50 Bảng 3.2. Hàm lượng Fucoidan thu nhận từ 06 loài rong nâu Việt Nam 51 Bảng 3.3. Hàm lượng Fucoidan thu nhận từ 07 loài rong nâu thế giới... 52 Bảng 3.4. Hàm lượng thu nhận và thành phần hóa học Fucoidan từ hai khu vực biển khác nhau..........................................................................................54 Bảng 3.5. Thành phần hóa học mẫu Fucoidan chiết từ rong S.microcystum..55 Bảng 3.6. Hàm lượng, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu Fucoidan phân lập từ 6 loài cùng chi với S.microcystum rong nâu Việt Nam .56 Bảng 3.7. Hàm lượng thu nhận các phân đoạn Fucoidan ...59 Bảng 3.8.Thành phần hóa học các phân đoạn chiết từ rong S.microcystum...62 Bảng 3.9. Một số mảnh đặc trưng trên phổ ESI-MS của Fucoidan .72
6. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Biểu đồ so sánh các ngành rong trên Thế giới ..8 Hình 1.2. Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu tỉnh Khánh Hòa ...................................................................................................... 14 Hình 1.3. Cấu trúc của Fucoidan từ F.vesiculosus được mô tả vào năm 1950 ......................................................................................................................... 19 Hình 1.4. Cấu trúc của Fucoidan có sunfat ở vị trí 4 và liên kết 3-O-linked từ loài rong E. Kurome được mô tả vào năm 1991 ........................................... 20 Hình 1.5. Cấu trúc Fucoidan phân đoạn F32 tách từ rong nâu Hizikia fusiforme..........................................................................................................21 Hình 1.6. Cấu trúc của một phân đoạn Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu A.nodusum ....................................................................................................... 21 Hình 1.7. Cấu trúc của một phân đoạn Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Cladosiphon okamuranus ................................................................................ 22 Hình 1.8. Cấu trúc của một phân đoạn Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Chorda filum ................................................................................................... 23 Hình 1.9. Cấu trúc Fucoidan từ Fucus serratus. ............................................. 24 Hình 1.10. Cấu trúc của Fucoidan từ Sargassum polycystum. ....................... 34 Hình 1.11. Mảnh cấu trúc cơ bản Fucoidan chiết tách từ rong Turbinaria decurrens ......................................................................................................... 37 Hình 1.12. Sơ đồ cấu trúc deS-2, deS-4, deS-6 rong Sargassum aquifolium .39 Hình 2.1. Mẫu rong Sargassum microcystum ................................................. 40 Hình 2.2. Sơ đồ chiết theo bản quyền Nga (Paten WO 2005,014657) ........... 41 Hình 2.3. Nguyên lý hoạt động của k thuật ion hóa ESI-MS .......................45 Hình 2.4. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate ...46 Hình 2.5. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate 46 Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đường đơn chuẩn 53
7. Hình 3.2. Phân đoạn Fucoidan được chiết từ rong S.microcystum bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose ...59 Hình 3.3. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F1 .60 Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F3 .61 Hình 3.5. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F4 .61 Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F5..61 Hình 3.7. Phổ hồng ngoại IR của mẫu Fucoidan thô được chiết tách từ rong Sargassum microcystum ..65 Hình 3.8. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F4 S.microcystum....................66 Hình 3.9a. Phổ 1H-NMR của F4......................................................................67 Hình 3.9b. Phổ 13C-NMR của F4....................................................................68 Hình 3.10. Phổ HSQC phân đoạn F4..............................................................70 Hình 3.11. Phổ ESI-MS của phân đoạn F4....................................................72 - Hình 3.12. Phổ ESIMS/MS của ion [FucSO3] , m/z 243 74 - Hình 3.13. Phổ ESIMS/MS của ion [Fuc2SO3] , m/z 389 ...75 - Hình 3.14. Phổ ESIMS/MS của ion [FucGalSO3] , m/z 405 ..76 Hình 3.15. Sự phân mảnh của Fucoidan từ rong nâu Sargassum microcystum dựa vào phổ ESI-MS/MS 78 Hình 3.16. Cấu trúc của Fucoidan F4 từ rong nâu Sargassum microcystum..79
8. 1 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 7 1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU ............................................................. 7 1.1.1. Giới thiệu về rong biển ...................................................................... 7 1.1.2. Giới thiệu về rong nâu ..................................................................... 12 1.1.2.1. Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới ............................... 12 1.1.2.2. Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam ................................. 12 1.1.3. Thành phần hóa học của rong Nâu .................................................. 15 1.1.3.1. Polysaccharide ............................................................................. 15 1.1.3.2. Một số hợp chất khác ................................................................... 16 1.2. TỔNG QUAN VỀ FUCOIDAN ........................................................... 17 1.2.1. Giới thiệu chung về Fucoidan ......................................................... 17 1.2.2. Thành phần hóa học của Fucoidan trong một số loài rong nâu ...... 17 1.2.3. Cấu trúc hóa học của Fucoidan ....................................................... 19 1.2.4. Tính chất hóa lý của Fucoidan ........................................................ 24 1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của Fucoidan ................................ 25 1.2.5.1. oạt t nh chống ng t máu và chống hu ết khối ...................... 25 1.2.5.2. oạt t nh chống virus ................................................................... 26 1.2.5.3. oạt t nh kháng u và iều hòa miễn dịch .................................... 26 1.2.5.4. oạt t nh chống ox hóa .............................................................. 27 1.2.5.5. Giảm lipid máu ............................................................................. 27 1.2.5.6. Kháng viêm ................................................................................... 27 1.2.5.7. Chống lại các bệnh về gan ........................................................... 28 1.2.5.8. oạt t nh kháng khuẩn ................................................................. 28
9. 2 1.2.5. . ác d ng giảm l ợng ng hu ết trong máu. ............................ 28 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI ................. 29 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................. 29 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ................................................... 32 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM ............................................................................................. 40 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................. 40 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 40 2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn Fucoidan ............................. 40 2.2.1.1. Ph ơng pháp chiết tách Fucoidan từ rong nâu ........................... 40 2.2.1.2. Ph ơng pháp phân oạn Fucoidan .............................................. 40 2.2.2. Phương pháp phân tích cấu trúc của Fucoidan ............................... 41 2.2.2.1. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng tổng carboh drate ................ 41 2.2.2.2. Ph ơng pháp xác ịnh thành phần monosaccharide ................... 41 2.2.2.3. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng sulfate ................................... 42 2.2.2.4. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng uronic axit ............................ 42 2.2.2.5. Ph ơng pháp phổ hồng ngoại IR ................................................. 42 2.2.2.6. Ph ơng pháp phổ cộng h ởng từ hạt nhân NMR ........................ 42 2.2.2.7. Ph ơng pháp phổ MS ................................................................... 45 2.3. THỰC NGHIỆM .................................................................................. 47 2.3.1. Chiết tách và phân đoạn tinh chế Fucoidan từ rong nâu ................. 47 2.3.2. Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate.......................................... 48 2.3.3. Phân tích thành phần monosaccharide ............................................ 48 2.3.4. Phân tích hàm lượng sulfate ............................................................ 49
10. 3 2.3.5. Phân tích hàm lượng uronic axit ..................................................... 49 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 50 3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU ........ 50 3.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC ........................................... 53 3.2.1. Xây dựng đường chuẩn ................................................................... 53 3.2.2. Phân tích thành phần hóa học của Fucoidan ................................... 54 3.2.3. Tách phân đoạn và thành phần hóa học các phân đoạn Fucoidan .. 58 3.3. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE SULFATE ..... 64 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 80 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................... 80 4.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 82