Luận văn Phân tích biến đổi di truyền của bệnh nhân mắc tật khuyết mống mắt ở Việt Nam

Nội dung tài liệu: Luận văn Phân tích biến đổi di truyền của bệnh nhân mắc tật khuyết mống mắt ở Việt Nam

1. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Vũ Đình Chất LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CỦA BỆNH NHÂN MẮC TẬT KHUYẾT MỐNG MẮT Ở VIỆT NAM Hà Nội – tháng 5 năm 2021
2. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Vũ Đình Chất LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CỦA BỆNH NHÂN MẮC TẬT KHUYẾT MỐNG MẮT Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.Nguyễn Hải Hà Hà Nội – tháng 5 năm 2021
3. Lời cam đoan Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Phân tích biến đổi di truyền của bệnh nhân mắc tật khuyết mống mắt ở Việt Nam” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và các cộng sự tại Viện nghiên cứu Hệ gen thuộc Viện Hàn Lâm Khoa Học Việt Nam. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các công trình khác. Nếu không đúng như đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình. Hà Nội, tháng 5 năm 2021 Học viên Vũ Đình Chất
4. Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hải Hà – Phó Trưởng Phòng phân tích hệ gen, Viện nghiên cứu hệ gen, người thầy – người chị đã theo sát và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập và làm luận văn. Thời gian làm tốt nghiệp cũng là lúc tôi gặp nhiều khó khăn và nghĩ tới bỏ cuộc, tuy vậy, chị Hà đã tận tình giúp tôi để tôi có thể hoàn thành Luận văn này. Những câu chữ ngắn gọn khó có thể giúp tôi diễn tả lòng biết ơn của mình đối với chị. Khoảng thời gian hơn một năm làm việc với chị giúp tôi học được nhiều điều và chắc chắn những kiến thức tôi thu lượm được sẽ là hành trang tốt cho tôi trên con đường phía trước. Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS. Nguyễn Đăng Tôn – Trưởng Phòng phân tích hệ gen, Ths. Nguyễn Thị Thanh Hoa cùng toàn thể các anh chị em đang làm việc và học tập tại đây. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ đã dành tâm huyết xây dựng môi trường nghiên cứu và học tập sáng tạo cho toàn thể học viên. Bên cạnh đó, để có thể hoàn thành được khoá học với nhiều thông tin bổ ích không thể không nhắc tới sự tận tuỵ của các thầy cô trong Học viện, đặc biệt thầy cô đang công tác tại Khoa Công nghệ Sinh học. Đồng thời thôi cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới toàn thể anh chị em cán bộ học viện đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong thời gian theo học tại đây. Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, vợ con, những người thân trong gia đình và bạn bè, các đồng nghiệp tại Labo IVF Hồng Ngọc đã luôn hỗ trợ, khích lệ và động viên tinh thần từ lúc tôi đăng ký thi và trong suốt quá trình học tập tại Học viện. Tôi xin chân thành cảm ơn!
5. Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt Microarray-based Comparative aCGH Lai so sánh hệ gen aCGH Genomic Hybridization BAC/YAC Bacterial/Yeast artificial Nhiễm sắc thể vi khuẩn/ chromosome nấm nhân tạo CTS C-terminal subdomain Tiểu vùng đầu C CTE C-terminal exptension Kéo dài đầu C DRR Downstream Regulatory Region Vùng điều hoà xuôi dòng EE Ectodermal enhancer ELP4 Elongator complex protein 4 Kỹ thuật lai huỳnh quang tại FISH Fluorescence in situ hybridization chỗ FOXC1 Forkhead Box C1 HD Homeodomain Vùng HD Inositol 1,4,5-Trisphosphate ITPR1 Receptor Type 1 KMM Khuyết mống mắt LNK Linker region Vùng liên kết LOVD Leiden open variation database Cơ sở dữ liệu đột biến mở Multiplex Ligation-dependent MLPA Probe Amplification Phân huỷ qua trung gian vô NMD Nonsense-mediated decay nghĩa NTS N-terminal subdomain Tiểu vùng đầu N Cơ sở dữ liệu trực tuyến Online Mendelian Inheritance in OMIM bệnh di truyền Menden ở Man người
6. PAX6 Paired box 6 PD Pair domain Vùng PD Paired-like homeodomain PITX2 transcription factor 2 P0/1/ α Promoter 0/1/α Vùng giàu proline, serine, PST Proline-serine-threonine domain threonine PTC Premature termination codon Mã kết thúc sớm TRIM44 Tripartite Motif Containing 44 UTR Untranslated region Vùng không dịch mã Wilms tumor-aniridia-genital WAGR anomalies-retardation Giải trình tự toàn bộ hệ gen WES Whole Exom Sequencing biểu hiện WGS Whole Genome Sequencing Giải trình tự toàn bộ hệ gen WT1 Wilms' tumor 1
7. Danh mục bảng biểu và hình ảnh HÌNH ẢNH Hình 1.1 Bệnh nhân KMM với đột biến PAX6 dị hợp tử biểu hiện kiểu hình mắt rất đa dạng..................................................................................................... 5 Hình 1.2: Lô-cut PAX6 ở người.......................................................................... 10 Hình 1.3: Các mất đoạn ADN trong locus 11p13 chứa vùng điều hoà 3' của PAX6 ................................................................................................................... 16 Hình 1.4: Tần xuất các kiểu đột biến trong cơ sở dữ liệu đột biến PAX6 .......... 17 Hình 1.5: Chiến lược xét nghiệm di truyền đối với những bệnh nhân khuyết mống mắt ............................................................................................................ 24 Hình 2.1: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu.......................................................... 28 Hình 3.1: Điện di kiểm tra ADN tổng số trên gel agarose 0.8% ....................... 38 Hình 3.2: Kết quả phân tích MLPA của bệnh nhân TMM4 ............................... 41 Hình 3.3: Kết quả phân tích MLPA của hai mẫu có đột biến mất đoạn ............ 42 Hình 3.4: Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm PCR từ mẫu dị tật mống mắt ..... 44 Hình 3.5: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 5 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn ............................................................................. 44 Hình 3.6: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 7 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn ............................................................................. 45 Hình 3.7: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 8 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn ............................................................................. 46 Hình 3.8: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 9 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn ............................................................................. 47 Hình 3.9: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 11 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn ............................................................................. 48 Hình 3.10: So sánh kết quả phân tích MLPA của bệnh nhân TMM12 (A) và người mẹ cũng mắc KMM (B) ............................................................................ 54
8. Hình 3.11: Sơ đồ phả hệ của bệnh nhân TMM11 .............................................. 55 BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Các thành phần điều hoà bảo thủ và sự điều hoà biểu hiện trong và ngoài mắt của gen PAX6 [26]. ........................................................................... 13 Bảng 2.1: Thông số cài đặt máy điện di mao quản để chạy phân tích MLPA ... 31 Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho khuếch đại vùng giáp ranh exon- intron và toàn bộ các exon của gen PAX6.......................................................... 32 Bảng 2.3: Thành phần PCR khuếch đại gen PAX6. ........................................... 34 Bảng 3.1: Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân KMM ......................................... 37 Bảng 3.2: Nồng độ ADN tổng số được xác định bằng ....................................... 39 Bảng 3.3: Bảng mối liên hệ giữa giá trị DQ và số lượng bản sao .................... 40 Bảng 3.4. Các đột biến gen phát hiện trên bệnh nhân KMM ............................. 49 Bảng 3.5: Đột biến và kiểu hình ở mỗi bệnh nhân ............................................. 50
9. MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4 TỔNG QUAN BỆNH KHUYẾT MỐNG.............................................. 4 1.1.1. Đặc điểm lâm sàng .......................................................................... 4 1.1.2. Hội chứng WGAR ........................................................................... 8 1.1.3. Hội chứng Gellespie ........................................................................ 8 CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA BỆNH KHUYẾT MỐNG MẮT ....................................................................................................................... 9 1.2.1. Cấu trúc và chức năng của gen PAX6 ............................................. 9 1.2.2. Sự điều hoà PAX6 .......................................................................... 12 1.2.3. Các đột biến trên PAX6 ................................................................. 16 1.2.3.1. Đột biến mã kết thúc sớm .............................................................. 17 1.2.3.2. Biến dị kéo dài đầu C (CTE) ......................................................... 18 1.2.3.3. Đột biến sai nghĩa ......................................................................... 18 1.2.3.4. Các đột biến trong vùng không mã hoá ........................................ 19 1.2.3.5. Đột biến cấu trúc ........................................................................... 19 1.2.3.6. Đột biến hai alen ........................................................................... 20 1.2.4. Các gen khác ................................................................................. 20 PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN ......................................................... 21 1.3.1. Chẩn đoán lâm sàng ...................................................................... 21 1.3.2. Chẩn đoán di truyền ...................................................................... 22 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH KHUYẾT MỐNG MẮT ........... 24 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 27
10. NGUYÊN VẬT LIỆU.......................................................................... 27 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................... 27 2.1.2. Hoá chất và thiết bị ........................................................................ 27 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 28 2.2.1. Thu mẫu ......................................................................................... 29 2.2.2. Tách chiết và đánh giá chất lượng ADN ....................................... 29 2.2.3. Xác định các đột biến cấu trúc bằng MLPA.................................. 29 2.2.4. Giải trình tự gen Sanger ................................................................ 32 2.2.4.1. Thiết kế mồi và PCR ...................................................................... 32 2.2.4.2. Giải trình tự gen ............................................................................ 35 2.2.4.3. Phân tích kết quả tìm đột biến sau giải trình tự ............................ 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 37 KẾT QUẢ ............................................................................................ 37 3.1.1. Kết quả thu thập mẫu nghiên cứu .................................................. 37 3.1.2. Tách chiết ADN tổng số ................................................................ 38 3.1.3. Phân tích đột biến cấu trúc bằng MLPA ....................................... 39 3.1.4. Kết quả PCR khuếch đại gen PAX6 .............................................. 43 3.1.5. Phát hiện đột biến bằng phương pháp giải trình tự ....................... 44 3.1.6. Đánh giá mối liên hệ kiểu gen và kiểu hình cho mỗi bệnh nhân .. 49 THẢO LUẬN....................................................................................... 51 KẾT LUẬN ...................................................................................................... 57 KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 59