Luận văn Nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa Protein Ompl1 của chủng Leptospira Spp. Trong Escherichia Coli

Nội dung tài liệu: Luận văn Nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa Protein Ompl1 của chủng Leptospira Spp. Trong Escherichia Coli

1. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Văn Huy NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN OmpL1 CỦA CHỦNG Leptospira spp. TRONG Escherichia coli LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - 2021
2. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Văn Huy NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN OmpL1 CỦA CHỦNG Leptospira spp. TRONG Escherichia coli Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. Nghiêm Ngọc Minh Hà Nội - 2021
3. i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Hà nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả Nguyễn Văn Huy
4. ii Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS.Nghiêm Ngọc Minh, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị, cũng như kinh phí để giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể Phòng Hệ gen học vi sinh, Viện Viện Nghiên cứu Hệ gen và đặc biệt là PGS.TS. Võ Thị Bích Thủy đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình thực nghiệm cũng như chia sẽ những kinh nghiệm chuyên môn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc khoa Sinh học, các thầy cô giáo của Học viện Khoa học và Công nghệ cùng với Lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi học tập cũng như hoàn thành đề tài nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình, người thân và bạn bè đã giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Nguyễn Văn Huy
5. iii Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt L. interrogans Leptoxspira interrogans L. interrogans Leptospira interrogans L. Bataviae Leptospira interrogans serovar Bataviae L. Canicola Leptospira interrogans serovar Canicola L. Grippotyphosa Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa Leptospira interrogans serovar L. Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae L. Pomona Leptospira interrogans serovar Pomona E.coli Escherichia coli LB Môi trường Luria Bertani Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại PCR gen) DNA Deoxyribonucleic acid Amp Ampicillin BSA Bovine Serum Albumins (Huyết thanh bò) TBST Tris-buffered saline với Tween 20 CBB Comassie Brilliant Blue SDS Sodium dodecyl sulfate IPTG Cơ chất Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside APS Ammonium persulphate EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid OD Optical density PBS Phosphate buffer saline TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine bp Base pair kb Kilobase kDa KiloDalton
6. iv Danh mục các bảng Bảng 1.1: Một số hệ biểu hiện phổ biến ......................................................... 19 Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 25 Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ................................................. 25 Bảng 2.3: Trình tự mồi khuếch đại toàn bộ gen OmpL1 ................................ 25 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng gắn gen vào vector nhân dòng .................... 28 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng cắt vector .................................................... 30 Bảng 2.6: Thành phẩn phản ứng nối gen vào vetor ........................................ 31 Bảng 2.7: Thành phần gel Acrylamide ........................................................... 32 Bảng 2.8: Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ........................... 33 Bảng 3.1: Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen OmpL1 .................................... 45 Bảng 3.2:Kết quả đo độ hấp phụ BSA ở bước sóng 595nm ........................... 57
7. v Danh mục các hình vẽ, đồ thị Hình 1.1: Xoắn khuẩn Leptospira interrogans .................................................. 3 Hình 1.2: Con đường lây truyền của bệnh Leptospirosis ................................. 5 Hình 1.3: Sơ đồ vector pET32a ....................................................................... 22 Hình 3.1: DNA tổng số tách chiết được của 5 chủng Leptospira ................... 37 Hình 3.2: Kết quả gióng hàng trình tự chuẩn của 5 chủng Leptospira interrogans ....................................................................................................... 41 Hình 3.3: Kết quả gióng hàng trình tự chuẩn của 5 chủng Leptospira interrogans (tiếp) ............................................................................................. 42 Hình 3.4: Kết quả dự đoán vùng quyết định kháng nguyên trên gen OmpL1 của năm chủng Leptospira .............................................................................. 43 Hình 3.5: Kết quả gióng hàng trình tự amino acid của năm chủng Leptospira ......................................................................................................................... 44 Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn gen OmpL1. ................................. 45 Hình 3.7: Điện di đồ sản phẩm cắt vector pJET1.2/OmpL1 ........................... 46 Hình 3.8: Điện di đồ sản phẩm plasmid .......................................................... 47 Hình 3.9: Điện di đồ sản phẩm cắt mở vòng vector pET32a .......................... 48 Hình 3.10: Khuẩn lạc E.coli đã được biến nạp vector pET32a/OmpL1 trên môi trường LB. ................................................................................................ 49 Hình 3.11: Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi T7 ................................... 49 Hình 3.12: Điện di đồ sản phẩm biểu hiện protein OmpL1 ở E. coli BL21 ... 50 Hình 3.13: Điện di đò sản phẩm biểu hiện của protein OmpL1 ở E. coli BL21 trong các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng khác nhau. ............................ 52 Hình 3.14: Điện di đồ sản phẩm biểu hiện của protein OmpL1 ở E. coli BL21 trong các điều kiện nồng độ cảm ứng IPTG khác nhau .................................. 54
8. vi Hình 3.15: Điện di đồ sản phẩm biểu hiện của protein OmpL1 ở E. coli BL21 trong các điều kiện thời gian cảm ứng IPTG khác nhau ................................. 55 Hình 3.16: Điện di đồ sản phẩm sau tinh sạch protein OmpL1 ...................... 56 Hình 3.17: Đồ thị biểu diễn đường hồi quy tuyến tính ................................... 57 Hình 3.18: Chuột nhắt trắng sử dụng trong thử nghiệm ................................. 59 Hình 3.19: Phản ứng Western Blot giữa kháng nguyên tái tổ hợp OmpL1 với kháng thể thu được từ huyết thanh chuột sử dụng kháng thể thứ cấp HRP Goat Anti-Mouse IgG. .................................................................................... 60
9. vii MỤC LỤC Lời cam đoan ...................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt .............................................................. iii Danh mục các hình vẽ, đồ thị ............................................................................ v MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................. 3 1.1. GIỚI THIỆU XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA VÀ BỆNH LEPTPSPIROSIS .......................................................................................... 3 1.1.1. Xoắn khuẩn Leptospira ................................................................. 3 1.1.2. Thực trạng dịch tễ bệnh Leptospirosis .......................................... 4 1.1.2.1. Trên thế giới ............................................................................ 4 1.1.2.2. Tại Việt Nam .......................................................................... 8 1.2. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PTOTEIN TÁI TỔ HỢP PHÒNG CHỐNG BỆNH LEPTOSPIROSIS .............................................................. 9 1.2.1. Đặc điểm bộ gen của xoắn khuẩn Leptospira ............................... 9 1.2.2. Một số nghiên cứu về protein OmpL1 tái tổ hợp ....................... 11 1.2.3. Cơ chế tạo kháng thể trong cơ thể của xoắn khuẩn Leptospira .. 14 1.3. TỔNG QUAN VỀ HỆ THỐNG BIỂU HIỆN GEN ........................... 18 1.3.1. Hệ biểu hiện Escherichia coli ..................................................... 18 1.3.1.1. Các hệ biểu hiện cơ bản ........................................................ 18 1.3.1.1. Hệ biểu hiện Escherichia coli. .............................................. 19 1.3.2. Chủng biểu hiện E. coli BL21 (DE3) ......................................... 20 1.3.3. Vector biểu hiện pET32a ............................................................ 21
10. viii CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.............. 23 2.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ ............................................................... 23 2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất.............................................................. 23 2.1.1.1. Nguyên liệu ........................................................................... 23 2.1.1.2. Hóa chất ................................................................................ 23 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu .................................................. 24 2.1.2.1. Thiết bị .................................................................................. 24 2.1.2.2. Dụng cụ thí nghiệm .............................................................. 24 2.1.2.3. Phần mềm phân tích .............................................................. 24 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 24 2.2.1. Thiết kế mồi đặc hiệu và PCR nhân gen OmpL1 ....................... 24 2.2.2. PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (Colony – PCR) ............................... 26 2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ............................... 26 2.2.4. Xác định trình tự acid nucleic ..................................................... 27 2.2.5. Gắn đoạn gen vào vector nhân dòng........................................... 27 2.2.6. Biến nạp vào tế bào E. coli khả biến .......................................... 28 2.2.7. Tách chiết và định lượng DNA plasmid ..................................... 29 2.2.8. Xử lý enzyme cắt giới hạn .......................................................... 30 2.2.9. Gắn gen vào vector biểu hiện pET32a ........................................ 31 2.2.10. Biểu hiện protein OmpL1 trong E.coli BL21 ............................. 31 2.2.11. Điện di protein trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) . 32 2.2.12. Phương pháp sắc ký ái lực .......................................................... 33 2.2.13. Phương pháp định lượng protein bằng Bradford ........................ 33