Luận văn Nghiên cứu tinh chế và xác định hoạt tính kháng khuẩn của Peptide Mastoparan từ Nọc ong Vespa Velutina thu ở Việt Nam

Nội dung tài liệu: Luận văn Nghiên cứu tinh chế và xác định hoạt tính kháng khuẩn của Peptide Mastoparan từ Nọc ong Vespa Velutina thu ở Việt Nam

1. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Thị Huế NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA PEPTIDE MASTOPARAN TỪ NỌC ONG Vespa velutina THU Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội- 2021
2. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Thị Huế NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA PEPTIDE MASTOPARAN TỪ NỌC ONG Vespa velutina THU Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn TS. Lê Thị Bích Thảo Hà Nội-2021
3. Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên cứu. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm. Tác giả luận văn Phạm Thị Huế
4. Lời cảm ơn Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Lê Thị Bích Thảo, người cô đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tới GS.TS. Phan Văn Chi, TS. Bùi Thị Huyền, TS. Phạm Đình Minh cùng toàn thể các anh chị làm việc tại phòng Hóa sinh Protein, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học; Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Thị Phương Liên, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; TS. Phạm Thị Hằng, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng- Côn trùng Trung ương; Trung tâm Bệnh nhiệt đới, Bệnh viện Bạch Mai; và ban Lãnh đạo, phòng Đào tạo, các phòng chức năng của Học viện Khoa học và Công nghệ đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, những người thân đã luôn khích lệ, động viên, giúp đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong quãng thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn!
5. Danh mục các ký hiệu và các chữ viết tắt Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitrile AMP Ampicillin Ampicillin CFU Colony-forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc CHCA α-Cyano-4- α-Cyano-4-hydroxycinnamic hydroxycinnamic acid acid CIP Ciprofloxacin Ciprofloxacin Da Dalton Dalton F7 Fraction 7 Phân đoạn 7 F9 Fraction 9 Phân đoạn 9 FA Formic acid Acid formic IMP Imipenem Imipenem KAN Kanamycin Kanamycin LEV Levofloxacin Levofloxacin LPS Lipopolysaccharid Lipopolysaccharid MALDI Matrix-assisted laser Kỹ thuật ion hóa theo cơ chế desorption/ionization giải hấp phụ sử dụng nguồn
6. laser với sự trợ giúp của chất nền MDRAB Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii kháng Acinetobacter baumannii đa thuốc mAu Milli Absorbance unit Mili đơn vị hấp thụ MCD Mast cell degranulating Phân hủy tế bào Mast MP Mastoparan Mastoparan tổng hợp MRSE Methicillin-resistant Methicillin-resistant Staphylococcus Staphylococcus epidermidis epidermidis MS Mass Spectrometry Khối phổ OXA Oxacilin Oxacilin PLA2 Phospholipase A-2 Phospholipase A-2 RP-HPLC Reverse Phase High- Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha Performance Liquid đảo Chromatography SAM Ampicillin/sulbactam Ampicillin/sulbactam SXT Trimethoprim/Sulfameth Trimethoprim/Sulfamethoxazol oxazole e TFA Trifluoroacetic acid Acid trifluoroacetic
7. TFE Tetrafluoroethylene Tetrafluoroethylene TOF Time of Flight Thời gian bay
8. Danh mục bảng Bảng 1.1 Một số protein và peptide chính được tìm thấy trong nọc ong . ..... 13 Bảng 1.2 Trình tự amino acid của một số peptide mastoparan từ nọc của một số loài ong ....................................................................................................... 18 Bảng 2.1 Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu ....................... 29 Bảng 2.2 Các thiết bị được sử dụng chính trong nghiên cứu ......................... 30 Bảng 3.1 Kết quả nhận diện phân đoạn 7 bằng phần mềm PEAK. ............... 40 Bảng 3.2 Kết quả nhận diện phân đoạn 9 bằng phần mềm PEAK. ................ 41 Bảng 3.3 Hiệu quả ức chế sinh trưởng của F9 trên các chủng vi khuẩn ........ 46 Bảng 3.4 Hiệu quả ức chế sinh trưởng của các phân đoạn F7 trên các chủng vi khuẩn. .............................................................................................................. 49 Bảng 3.5 Kết quả thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của MP trên các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh ............................................................ 52 Bảng 3.6 Mức độ nhạy cảm của các vi khuẩn đối với các MP và các loại thuốc kháng sinh ....................................................................................................... 56
9. Danh mục hình Hình 1.1 Ong Vespa velutina (Lepeletier) ....................................................... 5 Hình 1.2 Ong Vespa velutina nigrithorax cái mặt lưng (phía trên) và bụng (phía dưới) .................................................................................................................. 7 Hình 1.3 Ong Vespa velutina nigrithorax cái (bên trái) và đực (bên phải) ..... 8 Hình 1.4 Nọc ong săn mồi như một nguồn của các hợp chất có hoạt tính sinh học và các ứng dụng của chúng. ....................................................................... 9 Hình 1.5 Một số hợp chất trong thành phần trong nọc ong ........................... 10 Hình 1.6 Cấu trúc 3D của Mastoparan X được xác định bằng NMR. ........... 16 Hình 1.7 Sự so sánh trình tự của các gốc amino acid của các polypeptide tiền thân của mastoparan. ....................................................................................... 17 Hình 1.8 Các mô hình để giải thích các cơ chế của sự thấm qua màng ......... 24 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình các bước tiến hành ................................................. 31 Hình 3.1 Ong Vespa velutina cái .................................................................... 35 Hình 3.2 Cơ quan nọc độc của ong Vespa velutina sau khi được giải phẫu. 36 Hình 3.3 Sắc ký đồ của các phân đoạn của dịch chiết nọc ong Vespa velutina ......................................................................................................................... 37 Hình 3.4 Phổ MALDI-TOF của phân đoạn 7 (A) và phân đoạn 9 (B) ......... 39 Hình 3.5 Giải trình tự peptide các phân đoạn F7 (A) và F9 (B) có chứa mastoparan sử dụng De novo .......................................................................... 42 Hình 3.6 Sự so sánh trình tự của F7 và F9 với mastoparan từ các loài ong trong chi Vespa ......................................................................................................... 43 Hình 3.7 Phổ MALDI -TOF của MP trong hỗn hợp peptide sau khi tổng hợp ......................................................................................................................... 44 Hình 3.8 Hiệu quả ức chế sự sinh trưởng của mastoparan phân đoạn số 9 trên các chủng vi khuẩn .......................................................................................... 45
10. Hình 3.9 Hiệu quả ức chế sự sinh trưởng của mastoparan phân đoạn số 7 trên các chủng vi khuẩn .......................................................................................... 48 Hình 3.10 Kết quả Thử hoạt tính kháng khuẩn của MP trên các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh theo các nồng độ ................................................................ 53 Hình 3.11 Kết quả xác định mức độ nhạy cảm của MP và các kháng sinh đối với các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh ...................................................... 55