Luận văn Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp Bacteriocin

Nội dung tài liệu: Luận văn Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp Bacteriocin

1. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Trọng Bằng NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2021
2. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Trọng Bằng NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Huỳnh Hoàng Như Khánh Hà Nội – 2021
3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Huỳnh Hoàng Như Khánh và tham khảo thêm các tài liệu đã được công bố trước đó có nguồn gốc rõ ràng. Kết quả nghiên cứu này được thực hiện bởi sự tài trợ kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi sinh vật biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin nhằm ứng dụng trong nuôi trồng thủy hải sản”, mã số: VAST 02.05/20-21. Các số liệu nêu trong luận văn là kết quả làm việc của tôi trong suốt quá trình thực nghiệm tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2021 Tác giả luận văn Lê Trọng Bằng
4. LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Huỳnh Hoàng Như Khánh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Châu Minh Khánh - Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, người đã giúp tôi hoàn thành tốt phần thực nghiệm của mình, tôi xin chân thành cám ơn TS. Huỳnh Hoàng Như Khánh – Chủ nhiệm đề tài VAST 02.05/20-21 đã cho phép tôi sử dụng nội dung công trình nghiên cứu này vào mục đích nghiên cứu, viết và bảo vệ luận văn thạc sĩ. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đào Tấn Học và ThS. Lê Thị Thu Thảo, Viện Hải dương học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã hỗ trợ định danh đối với các mẫu tôm và cá biển sử dụng làm nguồn phân lập vi sinh vật biển trong luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Phòng Đào tạo, Khoa Công nghệ Sinh học và Quý Thầy Cô giáo đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn cũng như hoàn thành mọi thủ tục cần thiết. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang cũng như các anh, chị trong phòng Công nghệ sinh học biển đã giúp đỡ và tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến lãnh đạo trường THPT Nguyễn Chí Thanh, Sở Giáo dục và Đạo tạo Khánh Hòa luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2021 Tác giả luận văn Lê Trọng Bằng
5. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Thông tin đầy đủ Acute HepatoPancreatic Necrosis Disease AHPND (Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính) Vi khuẩn biển biểu hiện hoạt tính đối kháng với Bac+ Vibrio spp. Bacteriocin-like inhitory subtance BLIS (Hợp chất có đặc điểm giống bacteriocin) Gross Domestic Product GDP (Tổng sản phẩm quốc nội) Lab-Prepared Marine Agar LPMA (Môi trường thạch biển được chuẩn bị trong phòng thí nghiệm) NTTS Nuôi trồng thủy sản Polymerase Chain Reaction PCR (Phản ứng khuếch đại gen) PTN Phòng thí nghiệm rRNA Ribosome Ribonucleic Acid TCBS Thiosulphate Citrate Bile Salts Sucrose Agar TSA Tryptic Soy Agar TSB Tryptic Soy Broth VK Vi khuẩn VKB Vi khuẩn biển VSV Vi sinh vật VSVCT Vi sinh vật chỉ thị
6. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm ................. 10 Bảng 1.2. Một số vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản .................................. 13 Bảng 1.3. Tác động về kinh tế – xã hội và tác động khác của bệnh liên quan đến Vibrio trong ngành nuôi trồng thủy sản ................................................... 15 Bảng 1.4. Một số bacteriocin ở vi khuẩn Gram âm ........................................ 19 Bảng 1.5. Một số bacteriocin ở vi khuẩn Gram dương ................................... 20 Bảng 1.6. Một số khác biệt giữa bacteriocin và kháng sinh ........................... 22 Bảng 1.7. Độ bền nhiệt, pH và enzyme thủy phân của một số bacteriocin sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic .................................................................... 24 Bảng 1.8. Một số bacteriocin có nguồn gốc từ biển ....................................... 25 Bảng 2.1. Danh sách chủng chỉ thị sử dụng trong thí nghiệm sàng lọc hoạt tính ........................................................................................................... 36 Bảng 3.1. Thông tin về số lượng chủng VKB được phân lập tương ứng với từng mẫu và từng môi trường .......................................................................... 46 Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc những chủng cho hoạt tính đối kháng Vibrio spp. ....................................................................................................... 47 Bảng 3.3. Tổng hợp về hình thái khuẩn lạc của 30 chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. ghi nhận trên môi trường thạch Mueller Hinton ... 51 Bảng 3.4. Kết quả xác định phổ kháng khuẩn của 30 chủng vi khuẩn biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. xác định bằng phương pháp cấy dọc...... 54 Bảng 3.5. Tổng hợp khả năng kháng khuẩn của 30 chủng vi khuẩn biển biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch ........................................................................................ 57 Bảng 3.6. Hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus của 15 chủng vi khuẩn biển sau khi ủ với proteinase E ................................................................................ 61 Bảng 3.7. Sự biến động mật độ tế bào và hoạt tính đối kháng với vi sinh vật chỉ thị của chủng Bacillus spp. 2002NTBD1 theo thời gian ................................ 68
7. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. So sánh sản lượng nuôi trồng thủy sản và đánh bắt cá trên toàn cầu trong giai đoạn từ 1950 – 2017 ....................................................................... 11 Hình 1.2. Số lượng các ấn phẩm khoa học trong 20 năm qua liên quan đến từ khóa “marine bacteria” và “antimicrobial activity” phân phối theo mười quốc gia hàng đầu .................................................................................................... 17 Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin ................................................... 21 Hình 2.1. Quy trình phân lập vi khuẩn biển từ ruột tôm, ruột cá, bọt biển và rong .................................................................................................................. 39 Hình 2.2. Hình ảnh một số nguồn mẫu biển thu nhận cho phân lập vi khuẩn biển ................................................................................................... 40 Hình 2.3. Sơ đồ các nội dung nghiên cứu chính ............................................. 44 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn biển được làm thuần .................. 45 Hình 3.2 Hoạt tính đối kháng của VKB đối với 3 chủng Vibrio spp. được xác định bằng phương pháp cấy dọc ............................................................... 50 Hình 3.3. Hình thái của một số đại diện bac+ trên môi trường Mueller Hinton agar .................................................................................................................. 53 Hình 3.4. Phổ kháng khuẩn của VKB đối với 7 chủng VSVCT được xác định bằng phương pháp cấy dọc .............................................................................. 56 Hình 3.5. Khả năng sinh chất kháng khuẩn trong canh trường bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch ............................................................................... 59 Hình 3.6. Ảnh hưởng của enzyme lên hoạt tính kháng Vibrio spp. của dịch lên men chủng 2002NTBD1 ........................................................................... 62 Hình 3.7. Cây phân loại thể hiện mối liên quan giữa 4 chủng có hoạt tính mạnh và loài có trình tự gen 16S rRNA tương đồng ................................................ 63 Hình 3.8. Khảo sát độ bền nhiệt của hợp chất kháng Vibrio spp. sinh bởi 4 chủng vi khuẩn biển ..................................................................................... 67 Hình 3.9. Hoạt tính đối kháng với vi sinh vật chỉ thị của dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp. 2002NTBD1 các thời điểm sinh trưởng khác nhau .................. 69
8. 1 MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỤC LỤC ........................................................................................................ 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 8 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN ............................................................ 8 1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn ........................................................................ 8 1.1.2. Tác động của vi khuẩn ................................................................ 10 1.1.3. Vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản .......................................... 11 1.1.4. Vi khuẩn biển – nguồn cung cấp các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học ................................................................................................... 16 1.2. TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN ................................................... 17 1.2.1. Định nghĩa về bacteriocin ........................................................... 17 1.2.2. Phân loại bacteriocin ................................................................... 18 1.2.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin ............................................... 20 1.2.4. Điểm khác biệt giữa kháng sinh và bacteriocin .......................... 22 1.2.5. Đặc tính của bacteriocin ............................................................. 23 1.2.6. Một số bacteriocin có nguồn gốc từ biển .................................... 25 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN ................................................................................................. 27
9. 2 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới ....................................................... 27 1.3.2. Các nghiên cứu trong nước ......................................................... 29 1.4. TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA BACTERIOCIN .......................... 30 1.4.1. Ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm ...................... 30 1.4.2. Ứng dụng bacteriocin trong bảo vệ sức khỏe con người và động vật trên cạn ..................................................................................... 31 1.4.3. Ứng dụng bacteriocin trong nuôi trồng thủy sản ........................ 31 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 33 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .................................... 33 2.2. NGUYÊN LIỆU .................................................................................. 33 2.2.1. Vật liệu thí nghiệm ...................................................................... 33 2.2.2. Môi trường nuôi cấy ................................................................... 33 2.2.3. Chủng vi sinh vật chỉ thị ............................................................. 36 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 37 2.3.1. Phương pháp thu mẫu và phân lập vi khuẩn biển ....................... 37 2.3.2. Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng với Vibrio spp. của các chủng vi khuẩn biển phân lập được ........................................................ 40 2.3.3. Xác định phổ kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn biển được tuyển chọn ............................................................................................... 41 2.3.4. Xác định khả năng sinh chất kháng khuẩn trong môi trường lỏng .. 41 2.3.5. Xác định bản chất hợp chất kháng khuẩn ................................... 42 2.3.6. Phân tích trình tự nucleotide của gen mã hóa 16S rRNA ........... 42 2.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn ............................................................................................ 43 2.3.8. Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của vi khuẩn biển .................................................................................... 43
10. 3 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 45 3.1. PHÂN LẬP VI KHUẨN BIỂN .......................................................... 45 3.2. TUYỂN CHỌN CHỦNG BIỂU HIỆN HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI VIBRIO SPP. ....................................................................................... 47 3.3. PHỔ KHÁNG KHUẨN VI KHUẨN TRÊN MÔI TRƯỜNG THẠCH DINH DƯỠNG ........................................................................................... 53 3.4. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN TRONG DỊCH MÔI TRƯỜNG LỎNG .................................................................... 57 3.5. XÁC ĐỊNH BẢN CHẤT CỦA HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN ...... 60 3.6. PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA GEN MÃ HÓA 16S RRNA .......................................................................................................... 63 3.7. ĐỘ BỀN NHIỆT CỦA CÁC HỢP CHẤT KHÁNG VIBRIO SPP. ... 66 3.8. ẢNH HƯỞNG THỜI GIAN LÊN MEN ĐẾN KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN BIỂN .................................. 67 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................. 70 4.1. KẾT LUẬN ......................................................................................... 70 4.2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 71 PHỤ LỤC