Luận văn Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen Lipl21 mã hóa Lipoprotein từ Leptospira Interrogans trong Escherichia Coli

Nội dung tài liệu: Luận văn Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen Lipl21 mã hóa Lipoprotein từ Leptospira Interrogans trong Escherichia Coli

1. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Đặng Thị Quỳnh NGHIÊN CỨU NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN LipL21 MÃ HÓA LIPOPROTEIN TỪ Leptospira interrogans TRONG Escherichia coli LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội – tháng 04 năm 2021
2. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Đặng Thị Quỳnh NGHIÊN CỨU NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN LipL21 MÃ HÓA LIPOPROTEIN TỪ Leptospira interrogans TRONG Escherichia coli Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 19811017 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. TS. Nghiêm Ngọc Minh Hà Nội - 2021
3. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi. Các số liệu sử dụng phân tích trong luận văn có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các kết quả trong luận văn chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Đặng Thị Quỳnh
4. LỜI CẢM ƠN Hoàn thành đề tài nghiên cứu này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Nghiêm Ngọc Minh – Viện Nghiên cứu hệ gen – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen và các thầy cô Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Võ Thị Bích Thủy – trưởng phòng Hệ gen học vi sinh và các cán bộ, học viên, sinh viên thuộc phòng Hệ gen học vi sinh, những người đã giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Đặng Thị Quỳnh
5. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Amp Ampicillin APS Ammonium persulphate bp Base pair BSA Bovine Serum Albumins (Huyết thanh bò) CBB Comassie Brilliant Blue DNA Deoxyribonucleic acid E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb Kilobase kDa KiloDalton L. interrogans Leptospira interrogans L. Bataviae Leptospira interrogans serovar Bataviae L. Canicola Leptospira interrogans serovar Canicola L. Grippotyphosa Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa L. Icterohaemorrhagiae Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae
6. L. Pomona Leptospira interrogans serovar Pomona LB Luria Bertani LPS Lipopolysaccaride OD Optical density PBS Phosphate buffer saline Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại PCR gen) RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TBST Tris-buffered saline với Tween 20 TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine
7. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Ưu thế của từng loại vector pET .................................................... 15 Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi LipL21 Fw/Rv .................................................... 27 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 29 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector nhân dòng .................... 31 Bảng 2.4. Thành phẩn phản ứng gắn ............................................................. 35 Bảng 2.5. Công thức pha gel tách ................................................................... 37 Bảng 2.6. Công thức pha gel cô ...................................................................... 37 Bảng 2.7. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ........................... 40 Bảng 3.1. Các vị trí nucleotide khác biệt giữa năm chủng Leptospira ........... 45 Bảng 3.2. Trình tự các vùng epitope được dự đoán của gen Lipl21 ............... 46 Bảng 3.3. Kết quả đo độ hấp thụ BSA ở bước sóng 595nm ........................... 63
8. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Tỷ lệ mắc bệnh Leptospirosis ở người hàng năm trên toàn cầu 3 Hình 1.2. Hình dạng Leptospira interrogans dưới kính hiển vi (KHV) điện tử quét .................................................................................................................... 8 Hình 1.3. Cấu trúc màng của xoắn khuẩn Leptospira interrogans [2] ........... 11 Hình 1.4. Bản đồ gen vector nhân dòng pJET 1.2 (Thermo Scientific) ......... 14 Hình 1.5. Bản đồ gen vector biểu hiện pET (Novagen).................................. 18 Hình 1.6. Bản đồ gen vector biểu hiện pGEX-6P-3 (Merch) ......................... 19 Hình 1.7. Đánh giá khả năng gây miễn dịch của một số chủng Leptospira sử dụng kháng huyết thanh LipL32 tinh chế từ thỏ. ............................................ 22 Hình 1.8. Đánh giá và tiêu chuẩn hóa nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp LipL32 khi pha loãng huyết thanh với tỉ lệ 1:1000. ........................................ 24 Hình 3.1. Trình tự nucleotit của gen LipL21 tương đồng đối chiếu từ 5 chủng vi khuẩn L. interrogans. Tên các chủng vi khuẩn lần lượt được ký hiệu: ...... 44 Hình 3.2. Trình tự axit amin của gen LipL21 .................................................. 45 Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân bản gen LipL21 ............................ 48 Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen LipL21 từ plasmid trong các khuẩn lạc 1, 2, 3, 4, 5 và 6............................................................................... 49 Hình 3.5. Kết quả so sánh trình tự gen LipL21 của chủng L. Bataviae và trình tự gen LipL21 trong vector nhân dòng pJET-LipL21. .................................... 50 Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm vector pJET- LipL21. .................................... 51 Hình 3.7. Điện di đồ sản phẩm plasmid pET 32a ........................................... 52 Hình 3.8. Điện di đồ sản phẩm cắt vector pJET-LipL21 bằng enzyme giới hạn EcoRV và XhoI ................................................................................................ 53 Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm cắt vector pET32a bằng enzyme giới hạn EcoRV và XhoI ................................................................................................ 53 Hình 3.10. Điện di đồ kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi T7 promoter Fw/ T7 terminater Rv ................................................................................................... 54 Hình 3.11. Điện di đồ kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi LipL21 Fw/Rv .......... 55 Hình 3.12. Điện di đồ kiểm tra sự biểu hiện của protein LipL21 ở E. coli BL21 ................................................................................................................ 57 Hình 3.13. Điện di đồ kiểm tra sự biểu hiện của LipL21 ở E. coli BL21 trong các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng khác nhau. ...................................... 58 Hình 3.14 . Điện di đồ kiểm tra sự biểu hiện của LipL21 ở E. coli BL21 trong các điều kiện nồng độ cảm ứng IPTG khác nhau. .......................................... 60 Hình 3.15. Điện di đồ kiểm tra sự biểu hiện của LipL21 ở E. coli BL21 trong các điều kiện thời gian cảm ứng IPTG khác nhau. ......................................... 61 Hình 3.16. Đồ thị đường chuẩn BSA .............................................................. 63 Hình 3.17. Nồng độ protein của các phân đoạn tinh sạch thu được định lượng bằng Bradford .................................................................................................. 64
9. Hình 3.18. Điện di đồ kiểm tra sự biểu hiện của pET32a-LipL21 ở E. coli BL2 đã tinh sạch. ............................................................................................. 65 Hình 3.19. Phản ứng Western Blot giữa kháng nguyên tái tổ hợp LipL21 với kháng thể thu được từ huyết thanh chuột ........................................................ 66
10. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vi MỤC LỤC viii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH LETOSPIROSIS 2 1.1.1. Tổng quan tình hình thế giới 2 1.1.2. Tổng quan tình hình trong nước 6 1.2. VI KHUẨN LEPTOSPIRA 7 1.2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Leptospira 7 1.2.2. Đặc điểm cấu trúc và hệ gen vi khuẩn Leptospira 10 1.2.3. Gen LipL21, protein LipL21 liên quan đến độc lực của vi khuẩn Leptospira và tính ứng dụng 12 1.3. NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI 13 1.3.1. Biểu hiện protein ngoại lai trong E. coli 13 1.3.2. Nhân dòng và biểu hiện gen của vi khuẩn Leptospira interrogans 20 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU27 2.1. NGUYÊN LIỆU, MÁY MÓC 27 2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất 27 2.1.2. Máy móc, dụng cụ thí nghiệm 28 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.2.1. Phương pháp nhân dòng gen LipL21 vào vector pJET1.2 29 2.2.2. Phương pháp biểu hiện gen LipL21 trong E. coli BL21 32 2.2.3. Phương pháp thu, tinh sạch, đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của protein LipL21 tái tổ hợp 36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1. TẠO VECTOR MANG GEN LIPL21 43