Luận văn Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng sự hình thành xương của dẫn xuất Polysaccharide từ hạt cây Me (Tamarindus Indica l.)

Nội dung tài liệu: Luận văn Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng sự hình thành xương của dẫn xuất Polysaccharide từ hạt cây Me (Tamarindus Indica l.)

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Văn Ngọc NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CẢM ỨNG SỰ HÌNH THÀNH XƯƠNG CỦA DẪN XUẤT POLYSACCHARIDE TỪ HẠT CÂY ME (Tamarindus indica L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2021
2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Văn Ngọc NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CẢM ỨNG SỰ HÌNH THÀNH XƯƠNG CỦA DẪN XUẤT POLYSACCHARIDE TỪ HẠT ME (Tamarindus indica L.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: PGS.TS. Nguyễn Thị Mai Phương Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Thị Hồng Minh Hà Nội - 2021
3. 1 MỞ ĐẦU Loãng xương đang là căn bệnh phổ biến toàn cầu. Loãng xương làm tăng tính dòn của xương dẫn đến dễ bị gãy, vì thế ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe, cuộc sống của mỗi cá nhân và cả cộng đồng xã hội. Tổ chức y tế thế giới đang rất quan tâm và mong muốn cải thiện được tình trạng này, nhằm nâng cao sức khỏe cũng như chất lượng cuộc sống của con người. Tỷ lệ người bị loãng xương đang ngày một tăng lên ở cả các nước phát triển và đang phát triển, đặc biệt là với những người có tuổi. Các số liệu thống kê cho thấy khoảng trên 200 triệu người trên toàn thế giới bị bệnh này và khoảng 2,8 triệu người Việt Nam đang mắc phải bệnh loãng xương. Loãng xương xảy ra do sự mất cân bằng giữa sự mất xương và sự hình thành xương, trong đó sự hình thành xương xảy ra chậm hơn sự ấm t xương. Vì vậy, các nghiên cứu tập trung vào việc tìm kiếm các chất có hoạt tính làm tăng sự hình thành xương hoặc làm giảm sự mất xương để điều trị loãng xương đang là hướng nghiên cứu rất được quan tâm. Phần lớn các thuốc trên thị trường là các tác nhân làm giảm sự mất xương. Trong khi đó, chỉ có rất ít chất có khả năng cảm ứng làm tăng sự tạo xương. Thêm vào đó, việc sử dụng các thuốc hóa học hiện nay để xử lý loãng xương có một số hạn chế về hiệu quả cũng như gây phản ứng phụ khi sử dụng lâu dài. Do đó, việc phát hiện và sử dụng những chất tự nhiên có khả năng cảm ứng tái tạo xương mới, ít gây phản ứng phụ để xử lý bệnh loãng xương và duy trì độ bền của xương là hướng nghiên cứu mới, có nhiều tiềm năng ứng dụng để điều trị bệnh loãng xương cũng như các bệnh liên quan khác. Theo thống kê của Viện Dược liệu thì nước ta có khoảng 4000 loài thực vật được dùng làm thuốc ở các mức độ khác nhau. Các số liệu trên đây cho thấy tiềm năng to lớn của nguồn dược liệu Việt Nam rất phong phú, có thể sử dụng như nguồn nguyên liệu tiềm năng trong các nghiên cứu sàng lọc nhằm tìm ra những hợp chất có hoạt tính dược học quý hiếm, trong đó có các chất có tác dụng cảm ứng tái tạo xương mới và hiệu quả.
4. 2 Cây me (Tamarindus indica L.) thuộc họ Đậu (Fabaceae), là cây bản địa của vùng nhiệt đới châu Phi nhưng được phân bố rộng rãi trên toàn thế giới ở trên 50 quốc gia và cũng được trồng phổ biến ở Việt Nam. Polysaccharide từ hạt me (TSP) có nhiều hoạt tính sinh học quý và được ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. TSP có khả năng chống oxy hóa, hạ cholesterol, giảm khả năng xơ vữa thành mạch máu. TSP cũng có thể sử dụng như là một chất làm đặc và ổn định, làm tác nhân gel hóa, làm chất làm ổn định nước đá tinh thể và thay thế tinh bột vì nó có tính chất tươngtự như tinh bột nhưng ổn định hơn. TSP đã được thử nghiệm có hiệu quả trong điều trị bệnh về tiêu hóa và được sử dụng làm chất mang thuốc chữa bệnh đại tràng. Liên quan đến hướng nghiên cứu về tác dụng lên bảo vệ xương, các hợp chất tách chiết từ hạt me cũng đã được chứng minh là có tác dụngtích cực đối với một số bệnh xương khớp. Ngoài ra, các hợp chất polysaccharide tự nhiên từ quả me cũng đang được nghiên cứu theo hướng tạo vật liệu sinh học scaffold ứng dụng trong y dược. Mặc dù các công trình công bố đã chứng tỏ TSP và các dẫn xuất của nó có nhiều hoạt tính sinh học quý,có khả năng ứng ụngd đa dạng trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhưng các nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của TSP và các dẫn xuất của nó đối với quá trình biệthóa tế bào tạo xương vẫn còn thiếu vắng. Cho đến nay, chưa có công trình nào nghiên cứu một cách toàn diện và đầy đủ ảnh hưởng của TSP và các dẫn xuất của nó, đặc biệt là dẫn suất sulphate, đến quá trình tái tạo xương (TTX). Xuất phát từ những tồn tại chung, xu hướng nghiên cứu hiện nay, cũng như để góp phần khai thác nguồn nguyên liệu tự nhiên phong phú của nướcta, chúng tôi thực hiện đề tài luận văn: “Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng sự hình thành xương của dẫn xuất polysaccharide từ hạt me (Tamarindus indica L.)” nhằm đánh giá đầy đủ tác dụng cảm ứng sự hình thành xương của dẫn xuất TSP tiềm năng trên mô hình in vitro.
5. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ LOÃNG XƯƠNG 1.1.1. Lịch sử, định nghĩa, và phân loại loãng xương 1.1.1.1. Lịch sử bệnh loãng xương Loãng xương được xác định xuất hiện từ thời Ai Cập cổ đại năm 990 – TCN khi tìm thấy các xác ướp có bướu ở người hạ cấp. Thế kỷ 18, bác sĩ phẫu thuật người Anh John Hunter đã phát hiện ra rằng khi xương mới được đặt trong cơ thể, xương cũ sẽ bị phân hủy hoặc được tái hấp thụ. Quá trình phân hủy hay tái hấp thu này được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong bệnh loãng xương. Năm 1830, nhà nghiên cứu bệnh học người Pháp Jean Lobstein nhận thấy rằng xương của một số bệnh nhân bị thủng lỗ lớn hơn thông thường và ông đã đặt ra thuật ngữ loãng xương (xương xốp) để mô tả sự thay đổi của xương người. Bình thường Loãng xương Hình 1.1. Cấu trúc mô xương người bình thường so với người loãng xương [1]
6. 4 Mặc dù có lịch sử lâu đời nhưng định nghĩa bệnh loãng xương mới chỉ được Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO) chính thức đưa ra vào năm 1991 tại Thụy Sĩ và tiếp tục hoàn thiện cập nhật vào năm 2001[1]. Loãng xương được định nghĩa là một tình trạng rối loạn chuyển hóa của bộ xương làm giảm sức mạnh của xương dẫn đến làm tăng nguy cơgãy xương. Sức mạnh của xương được phản ánh thông qua hai yếu tố: khối lượng xương và chất lượng xương [2]. Đo mật độ xương sẽ cho ta biết lượng chất khoáng trong 1 đơn vị diện tích hoặc thể tích của xương. Còn chất lượng xương được đánh giá bởi các thông số: cấu trúc của xương, tốc độ chuyển hóa của xương, độ khoáng hóa, mức độ tổn thương tích lũy, tính chất của cácchất cơ bản của xương. 1.1.1.2. Phân loại bệnh loãng xương Dựa vào các yếu tố ảnh hưởng đến chuyển hóa xương, loãng xươngcó thể được phân thành hai nhóm chính là loãng xương nguyên phát (type 1 và type 2) do tuổi tác hoặc tình trạng mãn kinh và loãng xương thứ phát domột số bệnh mạn tính hoặc liên quan đến sử dụng một số loại thuốc 1.1.2. Cơ chế và các phương pháp điều trị bệnh loãng xương 1.1.2.1. Cơ chế Loãng xương xuất phát từ sự mất cân đối giữa hai hoạt động tạo xương và hủy xương mà cụ thể là lượng xương bị đào thảinhiều hơn lượng xương mới thay. Ở cấp độ phân tử, mô xương được cấu thành từ tế bào tạoxương (osteoblast), tế bào hủy xương (osteoclast) và nhóm một số tế bào khác. Những tế bào này tương tác với một số chất khoáng, protein, hormone vàcác phân tử khác để nuôi dưỡng xương, liên tục đục bỏ xương cũ thay bằng xương mới. Tế bào tạo xương (osteoblast) có nguồn gốc từ tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cell – MSC) có tác động thay đổi đến cấu trúc xương, tạo những lớp xương góp phần tạo lực của xương. Những tế bào này khiđặt trong điều kiện thích hợp có thể chuyển hóa thành tế bào xương nhưng trong
7. 5 điều kiện khác chúng cũng có thể trở thành tế bào cơ, mỡ hoặc sụn. Tếbào hủy xương (osteoclast) là những tế bào xuất phát từ tế bào tạo máu cóchức năng đục bỏ xương cũ hay xương bị tổn hại qua một quá trình phân hủy chất khoáng. Trong điều kiện bình thương, chức năng của tế bào hủy xương vàtế bào tạo xương hoạt động mức độ tương đương nhau và tín hiệu của loại tếbào này ảnh hưởng đến loại tế bào kia. Trong cơ thể con người, mô xương được cấu thành từ trong bụng mẹ và được làm mới duy trì sự phát triển qua hai quá trình là modelling và remodelling. Hai quá trình này xảy ra với những cơ chế riêng biệt để biệt hóa các nhóm tế bào xương, giúp đạt được sự tạo thành xương hoặc làm mới xương. Hai quá trình này, phối hợp nhau trong quá trình phát triển xương để định dạng xương thích hợp, duy trì nồng độ huyết thanh của các ion vàsửa chữa các vùng cấu trúc xương bị tổn thương. Hình 1.2. Quá trình remodel [3]
8. 6 Quá trình remodel là quá trình chu chuyển xương từ lúc còn nhỏ đến trước khi trưởng thành (18-20 tuổi). Chức năng của quá trình là hoàn chỉnh khối xương làm cho xương thay đổi kích thước hình dạng và tăng trưởng. Trong quá trình này, hai hoạt động tạo và hủy xương xảy ra một cách độc lập tại một vị trí, hoạt động tạo xương diễn ra mạnh hơn hủy xương. Quá trình remodel là quá trình diễn ra liên tục, suốt đời, nhưng tốc độ xảy ra giảmdần theo tuổi tác. Chức năng của quá trình là duy trì mật độ xương, phân hủy những mảng xương cũ hay xương bị tổn hại và thay thế bằng những mảng xương mới. Remodel là quá trình rất cần thiết để duy trì lực của xương. Quá trình này luôn xảy ra theo trình tự gồm: hoạt hóa (activation), hủy xương (resorption), trung gian (reversal), hình thành xương (bone formation) và khoáng hóa (mineralization). Quá trình remodel được bắt đầu khi các tế bào hủy xương (osteoclast) được biệt hóa và hoạt động để loại bỏ xương già, xương hỏng bằng cáchhấp thu các chất khoáng để lại những lỗ hổngtrên bề mặt xương. Tế bào đơn nhân (monocuclear cells) thu dọn các mảnh vụn được thải ra trong hoạt động hủy xương và chuẩn bị bề mặt đã được phục hồi trước khi tế bào tạoxương (osteoblast) sửa chữa xương bị tổn hại. Tiếp theo, tế bào tạo xương tổng hợp các thành phần hữu cơ và vô cơ của xương, thay thế phần xương đã bị hấp thụ thông qua quá trình biệt hóa tế bào tạo xương (osteoblast differentiation). Sự khoáng hóa xương (mineralization) và sự biệt hóa của một số tế bàotạo xương thành tế bào xương (osteocytes) là giai đoạn cuối để hoàn thành quá trình tái mô hình [4]. Trong quá trình remodel, hai hoạt động tạo và hủy xương diễn ra trên bề mặt xương với tốc độ 2-10% xương hằng năm. Trước khi bước vào giai đoạn trưởng thành hoạt động tạo xương diễn ra tương đương hoạt động hủy xương, do đó mật độ xương đạt mức độ cao ở độ tuổi20-30. Sau khi đạt mức tối đa, xương bắt đầu suy giảm với tốc độ khác nhau theo độ tuổi. Sau thời kỳ mãn kinh vài năm ở nữ và sau 50 tuổi ở nam, hoạt động hủy xương lấn át hoạt động tạo xương, tỷ lệ hủy xương và tạo xương mất cân bằng mà cụ thể làsự hình thành xương ít hơn sự hấp thụ xương, sẽ gây mất cân bằng nội mô xương
9. 7 và dẫn đến tình trạng cơ thể bắt đầuất m xương, mật độ xương, trọng lượng và độ cứng của xương giảm dẫn đếntình trạng loãng xương. Trong quá trình remodel, một số protein và các nhân tố như osterix (OSX), COX2 và Runx2 tham gia vào quá trình làm tăng sự biểu hiện của alkaline phosphatase (ALP), osteopontin (OPN) và osteocalcin (OSC). Đây là những nhân tố quyết định sự tạo ra tế bào xương trưởng thành (mature osteoblast) (Hình 1.3). Tế bào gốc trung mô từ tủy xương (MSC) đến thời điểm này đã được chứng minh là dòng tế bào gốc đa năng, vớikhả năng biệt hóa giới hạn trong các dòng tế bào thuộc lớp trung mô như tế bào xương, sụn, và mỡ. Tuy nhiên, một số thí nghiệm khác cũng cho thấy rằng dòng tế bào gốc này cũngcókhả năng biệt hóa thành tế bào gan, tế bào tim, tế bào thần kinh nhưng quátrình biệt hóa rất nhiều giai đoạn và có tỉ lệ thành côngthấp. Hình 1.3. Sơ đồ quá trình phát triển biệt hóa tế bào gốc (MSC) thành tế bào tạo xương [5]
10. 8 Quá trình biệt hóa tế bào xương trưởng thành từ tế bào gốc MSC trải qua 4 giai đoạn được chỉ ra trong hình 1.3. Bắt đầu của quá trình là từ tế bào gốc ở tủy – MSC (1), trải qua giai đoạn tăng sinh - proliferation (2) để trở thành tiền tế bào xương – pre-osteoblast (3) và qua giai đoạn khoáng hóa (mineralization) để trở thành tế bào xương trưởng thành – mature osteoblast (4) [2]. 1.1.2.2. Các phương pháp điều trị loãng xương Kiểm soát loãng xương có thể không dùng thuốc bao gồm việc cung cấp đủ canxi và vitamin D, tập thể dục tăng cân, cai thuốc lá, hạnchế uống rượu / caffein và các kỹ thuật phòng ngừa bịngã . Trong trường hợp phải điều trị loãng xương dùng thuốc thì định hướng hiên nay tập trung vào hai hướng là: Ức chế sự hấp thụ xương bởi tế bào hủy xương (osteoclast) Làm gia tăng các nhân tố tái tạo xương (TTX) thông qua biệt hóa các tế bào tạo xương (osteoblast differntiation). Hiệu quả điều trị của thuốc phụ thuộc vào tuổi tác, giới tínhvàsức khỏe của bệnh nhân. Các chất ức chế đang được sử dụng làbisphosphonates, chất chủ vận/ đối kháng estrogen [EAAs], estrogen, calcitonin và denosumab). Bisphosphonates vẫn là lựa chọn điều trị hàng đầu và tiết kiệm chi phí nhất cho bệnh loãng xương, nhưng ngày càng có nhiều lo ngại về tính an toàn lâu dài của chúng. Tuy nhiên, không phải tất cả các loại thuốc điều trị loãng xương đều được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) chấp thuận để điều trị loãng xương. Thuốc điều trị đầu tay cho hầu hết bệnh nhân có nguy cơ gãy xương cao bao gồm alendronate, risedronate, zoledronic acid và denosumab. Đối với những người không thể sử dụng liệu pháp uống và có nguy cơ gãy xương cao, nên sử dụng teriparatide, denosumab hoặc axit zoledronic. Đối với nam giới bị loãng xương, điều trị đầu tay là dung thuốc bisphosphonates [6].