Luận văn Nghiên cứu chuyển gen EcHB1 làm tăng chiều dài sợi gỗ vào Bạch Đàn lai up (Eucalyptus Urophylla x E.pellita) thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens

Nội dung tài liệu: Luận văn Nghiên cứu chuyển gen EcHB1 làm tăng chiều dài sợi gỗ vào Bạch Đàn lai up (Eucalyptus Urophylla x E.pellita) thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens

1. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thị Việt Hà NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN EcHB1 LÀM TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ VÀO BẠCH ĐÀN LAI UP (Eucalyptus urophylla x E. pellita) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Hà Nội - 2021
2. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thị Việt Hà NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN EcHB1 LÀM TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ VÀO BẠCH ĐÀN LAI UP (Eucalyptus urophylla x E. pellita) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: Hƣớng dẫn 1: TS. Trần Hồ Quang Hƣớng dẫn 2: TS. Lê Sơn Hà Nội - 2021
3. Lời cam đoan Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn là kết quả nghiên cứu của bản thân dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Trần Hồ Quang và TS. Lê Sơn. Mọi kết quả nghiên cứu cũng nhƣ ý tƣởng của các tác giả khác (nếu có) đều đƣợc trích dẫn cụ thể. Đề tài luận văn này cho đến nay chƣa đƣợc bảo vệ tại bất kỳ một hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nào cũng nhƣ chƣa đƣợc công bố trên bất kỳ phƣơng tiện nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về những lời cam đoan trên. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Ngƣời cam đoan Nguyễn Thị Việt Hà
4. Lời cảm ơn Tôi xin cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, phòng Đào tạo, các thầy giáo, cô giáo tại Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giảng dạy, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trƣờng. Tôi cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, cùng toàn thể các cán bộ Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy hƣớng dẫn, TS. Trần Hồ Quang (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và TS. Lê Sơn (Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam) đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Luận văn đƣợc sử dụng một phần số liệu và kết quả từ đề tài cấp Nhà nƣớc “Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ (giai đoạn 2)” do ThS. Trần Đức Vƣợng làm chủ nhiệm, thuộc Chƣơng trình trọng điểm phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh học trong Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đến 2020 mà Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp là đơn vị thực hiện. Xin chân thành cám ơn. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Nguyễn Thị Việt Hà
5. Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt STT Từ viết tắt Viết đầy đủ 1. AS Acetosyringone 2. BAP 6-Benzyl Amino Purine 3. CNSH Công nghệ sinh học 4. ĐC Đối chứng 5. ĐHST Điều hòa sinh trƣởng 6. ADN Acid Deoxyribonucleic 7. IBA Indole-3-Butyric Acid Institute of Forest Tree Improvement and 8. IFTIB Biotechnology 9. Km Kanamycin 10. LB Môi trƣờng nuôi cấy Luria and Betani 11. MS Môi trƣờng nuôi cấy Murashige & Skoog 12. NAA 1-Naphthyl Acetic Acid 13. OD Mật độ quang học (Optical Density) Phản ứng trùng hợp chuỗi (Polymerase Chain 14. PCR Reaction)
6. Danh mục các bảng Bảng 1.1. Các loài bạch đàn đƣợc nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ................................................................................................. 27 Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 40 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 40 Bảng 2.3. Chu trình phản ứng PCR................................................................. 40 Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin .......... 42 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ Kanamycin đến khả năng ra rễ .. 44 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của tuổi vật liệu đến mẫu tạo mô sẹo .......................... 45 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ................................................................................................ 47 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng mật độ vi khuẩn đến tỷ lệ chồi tái sinh ........................ 49 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ tạo mô sẹo ................ 50 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ........................................................................................................ 52 Bảng 3.8. Khả năng sống sót của chồi chuyển gen sau các lần chọn lọc ....... 56 Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra khả năng ra rễ của chồi chuyển gen sau các lần chọn lọc ........................................................................................................... 59 Bảng 3.10. So sánh hình thái thân giữa cây chuyển gen với cây đối chứng ... 60 Bảng 3.11. So sánh hình thái lá giữa cây chuyển gen và cây đối chứng ........ 61 Bảng 3.12. Đánh giá sinh trƣởng về chiều cao của cây con ngoài vƣờn ƣơm sau 1, 2 và 3 tháng .................................................................................................. 63 Bảng 3.13. Tổng hợp kết quả đo kích thƣớc lá ở giai đoạn 2 tháng tuổi ........ 64 Bảng 3.14. Tổng hợp kết quả đo kích thƣớc lá ở giai đoạn 3 tháng tuổi ........ 65
7. Danh mục các hình vẽ, đồ thị Hình 1.1. Tỷ lệ cây trồng biến đổi gen/tổng diện tích cây cùng loại của 5 nƣớc trồng cây biến đổi gen lớn nhất trên thế giới .................................................... 7 Hình 1.2. Tổng giá trị (USD) thu đƣợc từ cây trồng biến đổi gen toàn cầu ..... 9 Hình 1.3. Bạch đàn lai UP trồng khảo nghiệm tại Yên Bình – Yên Bái ........ 21 Hình 1.4. Cây con Bạch đàn lai UP bằng phƣơng pháp nhân giống in vitro .. 23 Hình 2.1. Vật liệu Bạch đàn lai UP sử dụng trong chuyển gen ...................... 31 Hình 2.2. Cấu trúc vector pGWB2/35S/EcHB1 ............................................. 32 Hình 2.3. Sơ đồ quy trình tái sinh thông qua phôi soma cho Bạch đàn lai UP ......................................................................................................................... 34 Hình 2.4. Vị trí các lá đƣợc chọn để đánh giá hình thái ................................. 38 Hình 3.1. Ảnh hƣởng ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Km đến chồi chƣa chuyển gen ....................................................................................................... 43 Hình 3.2. Bạch đàn lai UP 15 ngày tuổi tạo mô sẹo trên môi trƣờng chọn lọc .. 45 Hình 3.3. Mẫu bật chồi sau chuyển gen khi tiền nuôi cấy 48 giờ ................... 48 Hình 3.4. Mẫu nhiễm khuẩn với thời gian lần lƣợt sau 10 phút, 15 phút, 20 phút .................................................................................................................. 51 Hình 3.5. Sơ đồ quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai UP .............. 54 Hình 3.6. Mẫu chuyển gen tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc ........................ 55 Hình 3.7. Bình nhân chồi dòng Bạch đàn lai UP chuyển gen EcHB1 ............ 55 Hình 3.8. Chồi chuyển gen EcHB1 trên môi trƣờng chọn lọc ........................ 58 Hình 3.9. Hình thái thân và lá của dòng bạch đàn chuyển gen và đối chứng . 62 Hình 3.10. Cây bạch đàn chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn 2 tháng tuổi ......................................................................................................................... 63 Hình 3.11. Hình thái và kích thƣớc lá cây chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn 2 tháng tuổi ............................................................................................. 64
8. Hình 3.12. Hình thái và kích thƣớc lá cây chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn 3 tháng tuổi ............................................................................................. 66 Hình 3.13. Bạch đàn chuyển gen ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc và cây con tại vƣờn ƣơm ........................................................................................................ 67 Hình 3.14. Cây con chuyển gen EcHB1 trồng tại vƣờn ƣơm ......................... 67 Hình 3.15. Kết quả chạy điện di kiểm tra ADN một số dòng Bạch đàn lai UP ......................................................................................................................... 68 Hình 3.16. Kết quả PCR 40 dòng bạch đàn chuyển gen EcHB1 .................... 69 Hình 3.17. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen EcHB1 bằng PCR ................ 70
9. 1 MỤC LỤC MỤC LỤC ........................................................................................................ 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 6 1.1. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ...................................... 6 1.1.1. Hiện trạng và vai trò cây trồng biến đổi gen ........................................... 6 1.1.1.1. Hiện trạng cây trồng biến đổi gen ....................................................... 6 1.1.1.2. Vai trò của cây trồng biến đổi gen ....................................................... 8 1.1.1.3. Tình hình cây trồng biến đổi gen ở nước ta ......................................... 9 1.1.2. Các phƣơng pháp chuyển gen ......................................................... 11 1.1.2.1. Chuyển gen trực tiếp ........................................................................... 11 1.1.2.2. Chuyển gen gián tiếp .......................................................................... 12 1.1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen cây lâm nghiệp ............................... 13 1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................... 13 1.1.3.2. Các nghiên cứu trong nước ................................................................ 15 1.2. TỔNG QUAN VỀ CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP....................................... 17 1.2.1. Tổng quan về bạch đàn và Bạch đàn lai UP ......................................... 17 1.2.1.1. Tổng quan về bạch đàn ...................................................................... 17 1.2.1.2. Nghiên cứu và phát triển giống Bạch đàn lai UP ở Việt Nam .......... 20 1.2.3. Các hƣớng cải thiện giống bạch đàn bằng ứng dụng Công nghệ sinh học ......................................................................................................................... 22 1.2.3.1. Nhân giống vô tính in vitro cây bạch đàn .......................................... 22 1.2.3.2. Tái sinh in vitro thông qua sự hình thành callus và phôi soma ......... 24 1.2.3.3. Nghiên cứu phát triển và sử dụng các chỉ thị phân tử trong chọn tạo và lai giống ...................................................................................................... 25
10. 2 1.2.3.4. Chuyển gen cho loài bạch đàn ........................................................... 26 1.2.4. Gen EcHB1 và ứng dụng trong cải thiện chiều dài sợi gỗ .................... 28 1.2.4.1. Vai trò của nhân tố phiên mã trong sinh trưởng của thực vật ........... 28 1.2.4.2. Nhân tố phiên mã gen EcHB1 ............................................................ 30 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................................................................... 31 2.1. VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT ................................. 31 2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 31 2.1.2. Vật liệu di truyền và chủng vi khuẩn .................................................... 31 2.1.3. Trang thiết bị và hóa chất ...................................................................... 32 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 33 2.2.1. Nghiên cứu tái sinh in vitro ở các dòng Bạch đàn UP .......................... 33 2.2.2. Xác định ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin ........................... 35 2.2.3. Xác định tuổi vật liệu đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ................................... 35 2.2.4. Xác định thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo .................. 36 2.2.5. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens .................................. 36 2.2.6. Xác định thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo .................................................................................................................... 36 2.2.7. Xác định thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ............................................................................................................. 37 2.2.8. Tái sinh cây từ mẫu đã biến nạp gen, nhân các dòng biến nạp gen, ra rễ và trồng chăm sóc bên ngoài vƣờn ƣơm ......................................................... 37 2.2.9. Phƣơng pháp đánh giá hình thái cây chuyển gen .................................. 37 2.2.10. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số................................................. 38 2.2.11. Xác định sự có có mặt của gen trong cây chuyển gen bằng PCR ...... 39 2.2.12. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu .................................. 41