Luận văn Đánh giá sự biến đổi thành phần hóa học của Fucoidan được phân lập từ Rong nâu Sargassum Mcclurei theo các phương pháp chiết khác nhau

Nội dung tài liệu: Luận văn Đánh giá sự biến đổi thành phần hóa học của Fucoidan được phân lập từ Rong nâu Sargassum Mcclurei theo các phương pháp chiết khác nhau

1. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------------------------------- Nguyễn Trần Bảo Huy ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI THEO CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT KHÁC NHAU Chuyên ngành: Hoá phân tích Mã số: 8 44 01 18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Phạm Đức Thịnh PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân Hà Nội - 2021
2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Phạm Đức Thịnh và PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân. Các số liệu nêu trong luận văn là trung thực. Những kết luận khoa học của luận văn là chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Nha Trang - 2021 Tác giả Nguyễn Trần Bảo Huy
3. LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự quan tâm và giúp đỡ quý báu của các thầy cô, bạn bè và đồng nghiệp. Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Phạm Đức Thịnh và PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của TS. Cao Thị Thúy Hằng; ThS. Đinh Thành Trung và CN. Nguyễn Thị Khánh Vy đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của các quý thầy cô, anh chị học viên cao học các lớp CHE18 và CHE19 đang công tác và học tập tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang và Ban lãnh đạo Khoa Hóa học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành các học phần của luận văn và các thủ tục cần thiết. Tôi cũng xin cảm ơn Sở Giáo dục và Đào tạo Khánh Hòa, Ban lãnh đạo trường THPT Lý Tự Trọng, các anh chị em đồng nghiệp đã luôn tạo điều kiện trong công việc, động viên và trợ giúp tôi để tôi dành thời gian chuyên tâm học tập và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Nha Trang - 2021 Tác giả Luận văn Nguyễn Trần Bảo Huy
4. DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân Infrared Spectroscopy IR Phổ hồng ngoại desorption/ionization High Performance Liquid HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography CS Cell Survival Tế bào sống sót Nồng độ ức chế 50% IC50 Inhibitory Concentration 50% tăng trưởng của đối tượng thử MeOH Methanol Methanol EtOH Ethanol Ethanol TFA Trifluoroacetic acid Axit trifluoroacetic DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl Man Mannose Đường mannose Fuc Fucose Đường fucose Gal Galactose Đường galactose Gluc Glucose Đường glucose Xyl Xylose Đường xylose GluA Glucuronic Acid Axit glucuronic ManA Mannuronic Acid Axit mannuronic GuluA Guluronic Acid Axit guluronic
5. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1. 1. Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu .......... 10 Hình 1. 2. Phân tử Alginic acid ....................................................................... 12 Hình 1. 3. Cấu trúc của Laminaran ................................................................. 13 Hình 1. 4. Một đoạn cấu trúc Fucoidan........................................................... 13 Hình 1. 5. Cấu trúc của fucoidan có sunfat ở vị trí C-4 và liên kết 3-O-linked từ loài rong E. Kurome được mô tả vào năm 1991 ......................................... 17 Hình 1. 6. Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus .............................................. 18 Hình 1. 7. Cấu trúc của fucoidan từ Sargassum polycystum .......................... 30 Hình 1. 8. Mảnh cấu trúc cơ bản fucoidan chiết từ rong T. decurrens. .......... 32 Hình 1. 9. Sơ đồ cấu trúc deS-2, deS-4, deS-6 rong Sargassum aquifolium .. 34 Hình 2. 1. Rong khô S. mcclurei ..................................................................... 36 Hình 2. 2. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu bằng nước nóng . ......................... 38 Hình 2. 3. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) ........................................................................................... 39 Hình 2. 4. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu bằng dung dịch CaCl2 2% ........ 40 Hình 2. 5. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu có sự hỗ trợ của enzyme .............. 41 Hình 2. 6. Cơ chế hòa tan xenlulose của BmimCl .......................................... 41 Hình 2. 7. Sơ đồ chiết fucoidan từ rong nâu bằng chất lỏng ion . ..................... 42 Hình 3. 2. Mô hình cấu trúc thành tế bào của rong nâu ................................. 50 Hình 3. 3. Hình điện di C-PAGE của fucoidan chiết bằng các phương pháp chiết khác nhau. ............................................................................................... 53 Hình 3. 4. Phổ hồng ngoại IR của mẫu fucoidan thô được chiết từ TN1 ....... 62 Hình 3. 5. Phổ hồng ngoại IR của mẫu fucoidan thô được chiết từ TN2 ....... 63 Hình 3. 6. Phổ hồng ngoại IR của mẫu fucoidan thô được chiết từ TN3 ....... 64 Hình 3. 7. Phổ hồng ngoại IR của mẫu fucoidan thô được chiết từ TN4 ....... 65 Hình 3. 8. Phổ hồng ngoại IR của mẫu fucoidan thô được chiết từ TN5 ....... 65
6. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1. Thành phần hóa học của một số loài rong ..................................... 11 Bảng 1. 2. Thành phần hóa học của một số fucoidan .................................... 16 Bảng 1. 3. Cấu trúc hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu ......... 26 Bảng 1. 4. Hàm lượng, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam .............................................. 32 Bảng 1. 5. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD. .................................... 33 Bảng 2. 1. Các đỉnh phổ đặc trưng của fucoidan trên phổ hồng ngoại ........... 45 Bảng 3. 1. Kết quả phân tích thành phần hóa học của rong nguyên liệu ........ 49 Bảng 3. 2. Hiệu suất thu nhận fucoidan từ các phương pháp chiết ............... 52 Bảng 3. 3. Hàm lượng fucoidan thu nhận từ các loài rong ............................. 55 Bảng 3. 4. Thành phần hóa học fucoidan thu nhận được................................ 56 Bảng 3. 5. Nhận xét các chỉ số thành phần hóa học fucoidan thu nhận được 57 Bảng 3. 6. Thành phần đường đơn của fucoidan thu nhận được .................... 58 Bảng 3. 7. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các mẫu ............................ 61 Bảng 3. 8. Hàm lượng hoạt tính oxy hóa tổng fucoidan thu nhận được ......... 67 Bảng 3. 9. Khả năng bắt gốc DPPH của fucoidan chiết từ rong nâu .............. 68
7. DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Đường chuẩn carbohydrate tổng số ............................................... 79 Phụ lục 2. Đường chuẩn Fucose...................................................................... 80 Phụ lục 3. Đường chuẩn Galactose ................................................................. 81 Phụ lục 4. Đường chuẩn Glucose .................................................................... 82 Phụ lục 5. Đường chuẩn Sulfate...................................................................... 83 Phụ lục 6. Đường chuẩn Uronic acid .............................................................. 84 Phụ lục 7. Đường chuẩn Poly phenol .............................................................. 85 Phụ lục 8. Đường chuẩn Protein ..................................................................... 86 Phụ lục 9. Đường chuẩn Hoạt tính chống oxy hóa tổng số ............................ 87
8. 1 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 8 1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN ............................................................... 8 1.1.1. Giới thiệu rong biển .......................................................................... 8 1.1.2. Giới thiệu rong nâu ........................................................................... 8 1.1.3. Một số thành phần hóa học trong rong nâu ................................. 10 1.1.3.1. Polysaccharide ........................................................................... 12 1.1.3.2. Hợp chất Phenolic ..................................................................... 14 1.1.3.3. Hợp chất Carotenoid ................................................................. 14 1.1.3.4. Hợp chất Terpenoid ................................................................... 14 1.1.3.5. Protein ........................................................................................ 14 1.2. TỔNG QUAN VỀ FUCOIDAN .............................................................. 15 1.2.1. Thành phần hóa học của fucoidan ................................................ 15 1.2.2. Đa dạng cấu trúc của fucoidan ...................................................... 16 1.2.3. Hoạt tính sinh học của fucoidan .................................................... 18 1.2.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng virus ...................................... 18 1.2.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa ............................................................ 19 1.2.3.3. Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch .................................. 19 1.2.3.4. Hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối ................... 20 1.2.3.5. Chống lại các bệnh về gan ......................................................... 21 1.2.3.6. Giảm lipid máu........................................................................... 21 1.2.4. Ứng dụng của fucoidan ................................................................... 22 1.3. TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT FUCOIDAN .......... 23
9. 2 1.3.1. Phương pháp chiết fucoidan trong axit pH 2-3 ............................ 23 1.3.2. Phương pháp chiết fucoidan trong nước nóng ............................. 23 1.3.3. Phương pháp chiết fucoidan trong dung dịch CaCl2 2% ........... 23 1.3.4. Phương pháp chiết fucoidan bằng ethanol ................................... 24 1.3.5. Phương pháp chiết fucoidan bằng chất lỏng ion .......................... 24 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU FUCOIDAN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM ..................................................................................................... 26 1.4.1 Tình hình nghiên cứu fucoidan trên thế giới ................................. 26 1.4.2. Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam ................................. 28 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM .......................................................................... 35 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 35 2.1.1. Rong nâu Sargassum mcclurei ....................................................... 35 2.1.2. Chuẩn bị hóa chất và thiết bị ......................................................... 36 2.1.2.1. Hóa chất ..................................................................................... 36 2.1.2.2. Thiết bị ....................................................................................... 37 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 37 2.2.1. Phương pháp chiết fucoidan .......................................................... 37 2.2.1.1. Phương pháp chiết fucoidan bằng nước nóng ........................... 37 2.2.1.2. Phương pháp chiết fucoidan bằng dung dịch HCl (pH:2-3) ..... 38 2.2.1.3. Phương pháp chiết fucoidan bằng dung dịch CaCl2 2% ........... 39 2.2.1.4. Phương pháp chiết fucoidan có sự hỗ trợ của enzyme .............. 40 2.2.1.5. Phương pháp chiết fucoidan bằng chất lỏng ion ....................... 41 2.2.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của fucoidan .......... 42 2.2.2.1. Phương pháp phân tích hàm lượng tổng carbohydrate ............. 42
10. 3 2.2.2.2. Phương pháp phân tích thành phần đường đơn ........................ 43 2.2.2.3. Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate ................................ 43 2.2.2.4. Phương pháp phân tích hàm lượng uronic acid ........................ 43 2.2.2.5. Phương pháp phân tích hàm lượng polyphenol ........................ 44 2.2.2.6. Phương pháp phân tích hàm lượng protein ............................... 44 2.2.2.7. Phương pháp phân tích vị trí của nhóm sulfate trong fucoidan 44 2.2.2.8. Phương pháp điện di trên gel carbonhydrate-polyacrilamide .. 45 2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa của fucoidan ........... 46 2.2.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính oxy hóa tổng số ..................... 46 2.2.3.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH. ..... 46 2.3. THỰC NGHIỆM ...................................................................................... 47 2.3.1. Thu thập và xử lý rong nâu Sargassum mcclurei ......................... 47 2.3.2. Chiết fucoidan trong rong nâu Sargassum mcclurei .................... 47 2.3.3. Xác định thành phần hóa học của fucoidan ................................. 48 2.3.4. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của fucoidan .......................... 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 49 3.1. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ............................................................. 49 3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN RONG NGUYÊN LIỆU ...... 49 3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT CHIẾT FUCOIDAN TỪ RONG SARGASSUM MCCLUREI BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁC NHAU .... 51 3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LÊN THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN CHIẾT TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI .................................................................... 55 3.5. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LÊN VỊ TRÍ CỦA NHÓM SULFATE TRÊN FUCOIDAN CHIẾT TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI ....................................................... 60